"Proteolytische Prozesse an peroxisomalen Proteinen aus Sonnenblumenkotyledonen"

Meine Diplomarbeit: Proteolytische Prozesse an peroxisomalen Proteinen aus Sonnenblumenkotyledonen
Meist hört nach diesem Titel jede weitere Frage erst einmal auf.
Dabei ist die Arbeit ein gutes Beispiel dafür, wie eng Biologie, Chemie, Physik, Mathematik und Statistik in den Naturwissenschaften miteinander verbunden sind.
Im Mittelpunkt meiner Diplomarbeit stand die Frage, wie Proteine in pflanzlichen Peroxisomen beziehungsweise Glyoxysomen abgebaut werden. Dazu wurden Organellen aus Sonnenblumenkotyledonen isoliert, unter definierten Bedingungen untersucht und der Abbau unter anderem an der Katalase verfolgt.
Zum Einsatz kamen dabei sehr unterschiedliche Methoden und Denkweisen:

• Zellbiologie und Biochemie zur Untersuchung von Peroxisomen und Enzymen
• Chemie zur Einstellung von pH-Werten, Oxidationsbedingungen und Hemmstoffen
• physikalische Trennverfahren wie die Dichtegradientenzentrifugation
• Proteinanalytik mit Elektrophorese, Western Blot und Immunodetektion
• Enzymaktivitätsmessungen
• statistische Auswertung, beispielsweise mit dem U-Test
• mathematische Auswertung und Interpretation von Messreihen

Besonders interessant war, dass nicht jedes Experiment so verlief wie erwartet. Gerade unerwartete Ergebnisse führten zu neuen Hypothesen und weiteren Versuchen.
Diese Verbindung verschiedener Fachgebiete prägt bis heute auch meinen Unterricht.
Mein teilweise recht umfangreiches Unterrichtsspektrum ist daher kein Zufall: Naturwissenschaftliche Fragestellungen lassen sich häufig nur dann wirklich verstehen, wenn man biologische, chemische, physikalische und mathematisch-statistische Zusammenhänge gemeinsam betrachtet.

Was sind Peroxisomen und Glyoxysomen?

Peroxisomen sind kleine, von einer Membran umschlossene Zellorganellen eukaryotischer Zellen. Sie enthalten zahlreiche Enzyme und spielen unter anderem bei oxidativen Stoffwechselprozessen eine wichtige Rolle. Besonders bekannt ist die Katalase, die Wasserstoffperoxid abbaut und damit die Zelle vor dessen schädigender Wirkung schützt.
Eine besondere Form der Peroxisomen sind die Glyoxysomen, die vor allem in keimenden ölreichen Pflanzensamen von Bedeutung sind. In ihnen laufen Stoffwechselwege ab, die es dem Keimling ermöglichen, gespeicherte Fette für Wachstum und Energiegewinnung nutzbar zu machen.
Bei der Keimung beispielsweise von Sonnenblumen verändern sich Zusammensetzung und Funktion dieser Organellen erheblich.

Die Ausgangsfrage
Vorangegangene Untersuchungen hatten gezeigt, dass die Proteine dieser Organellen einem Proteinturnover unterliegen. Proteine verschwinden also und werden durch andere ersetzt.
Damit stellte sich eine grundlegende Frage:
Wie werden die Proteine der Peroxisomen eigentlich abgebaut?
Dafür waren prinzipiell unterschiedliche Mechanismen denkbar.
Eine Möglichkeit wäre, dass komplette Peroxisomen von der Zelle beseitigt und anschließend abgebaut werden.
Eine andere Möglichkeit wäre, dass sich proteolytische Enzyme direkt in den Peroxisomen befinden, die einzelne Proteine innerhalb des Organells abbauen können.
Mit dieser zweiten Möglichkeit beschäftigte ich mich in meiner Diplomarbeit.

Suche nach proteolytischer Aktivität in Peroxisomen
Zunächst mussten Peroxisomen aus den Kotyledonen von Sonnenblumen isoliert werden. Dazu wurden Zellbestandteile mithilfe einer Dichtegradientenzentrifugation voneinander getrennt.
Als Modellprotein für die Abbauversuche verwendete ich Katalase, ein charakteristisches Enzym der Peroxisomen.
Die Versuche wurden in einem alkalischen Milieu durchgeführt. Ausgangspunkt war die damalige Annahme, dass im Inneren der untersuchten Peroxisomen ein alkalischer pH-Wert vorliegen könnte. Deshalb wählte ich für die Abbauversuche pH 9.
Die Überlegung war einfach:
Befindet sich im Peroxisomenisolat eine Protease, sollte Katalase in Gegenwart dieses Isolates stärker abgebaut werden als in einer Kontrollprobe ohne Peroxisomen.
Das erste Experiment funktioniert nicht
Zunächst wurde der Abbau indirekt über die Abnahme der Katalaseaktivität verfolgt.
Dabei trat allerdings ein Problem auf:
Die Aktivität der Katalase nahm auch in der Kontrollprobe ab, obwohl dort kein Peroxisomenisolat und damit auch keine vermutete peroxisomale Protease vorhanden war.
Die Aktivitätsverluste von Versuchs- und Kontrollprobe ließen sich statistisch nicht voneinander unterscheiden. Zur Auswertung wurde unter anderem ein U-Test eingesetzt.
Damit war klar:
Eine Abnahme der Enzymaktivität allein war kein ausreichender Nachweis für einen proteolytischen Abbau der Katalase.
Das Experiment hatte damit zunächst nicht die erwartete Antwort geliefert – führte aber zu einer neuen Versuchsrichtung.

Ein unerwartetes Ergebnis mit Quecksilberionen
Im nächsten Schritt sollte ein möglicher enzymatischer Abbau gehemmt werden.
Dazu wurden Hg²⁺-Ionen eingesetzt, da Schwermetallionen Proteasen beziehungsweise deren funktionelle Gruppen hemmen können. Eigentlich war also zu erwarten, dass der Abbau der Katalase geringer würde.
Das Gegenteil geschah.
Die Katalase wurde unter diesen Bedingungen massiv in kleinere Fragmente zerlegt.
Der Abbau ließ sich durch Western Blot und Immunodetektion sichtbar machen. Statt des intakten Katalaseproteins erschienen kleinere Proteinfragmente.
Die Katalase wurde unter diesen Bedingungen gewissermaßen regelrecht „zerfressen“.
Entscheidend war offenbar die Struktur der Katalase
Dieser unerwartete Befund führte zu einer neuen Hypothese.
Vielleicht bestimmte nicht allein die Anwesenheit einer Protease, ob Katalase abgebaut werden konnte.
Möglicherweise musste sich zunächst die Struktur des Katalaseproteins verändern, damit proteolytische Angriffspunkte zugänglich wurden.
Daraufhin untersuchte ich weitere Bedingungen, die die Proteinstruktur beziehungsweise den Oxidationszustand der Katalase beeinflussen konnten.
Zum Einsatz kamen verschiedene Oxidationsmittel.
Auch unter oxidierenden Bedingungen wurde die Katalase zunehmend  zerlegt. Bruchstücke traten jedoch nicht auf, sie verschwand daher durch kompletten Abbau.
Ein ähnlicher Effekt trat bei Belichtung auf.
Damit zeichnete sich ein Muster ab:
Oxidative Veränderungen der Katalase machten das Protein offenbar empfindlicher gegenüber einem proteolytischen Abbau.
Ein möglicher Zusammenhang zwischen Oxidation und Proteinabbau
Aus den Experimenten ergab sich damit ein interessantes Modell.
Unter den untersuchten Bedingungen begünstigten zwei Faktoren den Abbau der Katalase:

• ein alkalisches Milieu um pH 9
• ein oxidatives Milieu beziehungsweise eine oxidative Veränderung des Proteins

Gerade diese Kombination war für die damalige Fragestellung besonders interessant, weil Peroxisomen Orte intensiver oxidativer Stoffwechselprozesse sind.
Dort entsteht unter anderem Wasserstoffperoxid – genau jenes Molekül, das normalerweise durch Katalase abgebaut wird.
Damit ergab sich die Vorstellung, dass oxidative Veränderungen eines peroxisomalen Proteins möglicherweise selbst ein Signal oder zumindest eine Voraussetzung für dessen anschließenden proteolytischen Abbau darstellen könnten.

Warum der pH-Wert eine Rolle spielen könnte
Ein weiterer interessanter Aspekt war die mögliche räumliche Begrenzung eines solchen Abbaus.
Eine Protease, die ihre höchste Aktivität unter stark alkalischen Bedingungen besitzt, würde unter den annähernd neutralen Bedingungen des Cytoplasmas wesentlich weniger wirksam sein.
Damit wäre grundsätzlich ein Mechanismus denkbar, bei dem bestimmte proteolytische Aktivitäten bevorzugt innerhalb des Organells stattfinden.
Die Proteine könnten dort unter den besonderen chemischen Bedingungen des Peroxisoms verändert und anschließend abgebaut werden, ohne dass dieselbe Protease im gesamten Cytoplasma gleichermaßen aktiv wäre.

Was ich aus dieser Arbeit mitgenommen habe
Die Arbeit zeigte für mich sehr anschaulich, wie naturwissenschaftliche Forschung tatsächlich funktioniert.
Das wichtigste Experiment ist nicht immer dasjenige, das so funktioniert wie geplant.
Mein erster Ansatz, den Proteinabbau einfach über eine Abnahme der Katalaseaktivität nachzuweisen, lieferte zunächst kein verwertbares Ergebnis.
Gerade das unerwartete Verhalten der Kontrollproben und später der überraschende Effekt der Hg²⁺-Ionen führten jedoch zu einer neuen Fragestellung:
Welche Rolle spielt der strukturelle und oxidative Zustand eines Proteins für seinen Abbau?
Aus einem scheinbar fehlgeschlagenen Versuch entstand damit eine neue Arbeitshypothese und eine Reihe weiterer Experimente.
Genau darin liegt ein wesentlicher Teil naturwissenschaftlichen Arbeitens:
beobachten, vergleichen, Hypothesen bilden, experimentell prüfen – und unerwartete Ergebnisse ernst nehmen.